Bucear en lo invisible

Logran mayor resolución en imágenes nanométricas.

A través de un microscopio óptico, un grupo de investigadores pudo -una vez más- romper los límites de visualización adentro de una célula.

En un paper que publicó la Revista Science el 22 de diciembre de 2016, los científicos presentaron un nuevo método de super-resolución llamado MINFLUX que permite localizar moléculas y seguir sus movimientos usando una mínima cantidad de fotones.

Fernando Stefani del Departamento de Física y el CIBION-CONICET.

Imágenes obtenidas con nanoscopios de fluorescencia -herramientas de laboratorio muy específicas que permiten ver objetos mil millones de veces más pequeños que el metro- alcanzan mayor capacidad de detalle y definición. Los microscopios ópticos convencionales proveen imágenes con detalles de hasta 200 nanómetros (nm). Los recientes métodos de nanoscopía de fluorescencia, también conocidos como microscopía de súper-resolución no tienen esta limitación, pero en muestras biológicas el nivel de detalle alcanzable se ha visto restringido a 20 – 30 nm  por razones técnicas. El nuevo concepto de MINFLUX consiguió imágenes de resolución  de 1nm.

 “El nivel de detalle que uno puede ver con el mejor de los microscopios ópticos está limitado por la naturaleza ondulatoria de la luz, no se identifican rasgos menores a dos centenares de nanómetros. Si bien esta dimensión es algo muy chiquito, en términos moleculares resulta enorme”, contextualiza Fernando Stefani, uno de los autores del paper, profesor del Departamento de Física de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.

La vida en colores

Las técnicas de visualización por fluorescencia permiten distinguir por medio del contraste entre colores los diferentes componentes del objeto observado, ya sea una célula viva, complejos proteicos o moléculas de ADN. 

Imágenes de fluorescencia de un Tripanosoma cruzi. Izquierda: imágenes obtenidas mediante microscopía de fluorescencia tradicional, donde la resolución espacial está limitada a unos 200 n. Derecha: imágenes obtenidas mediante nanoscopía de fluorescencia STED, con resolución espacial de 40 nm.

Stefani aclara que desde hace aproximadamente 20 años se buscan métodos ópticos, aprovechando el fenómeno de fluorescencia, que permitan obtener imágenes con mejor resolución espacial. La invención de los métodos de nanoscopía de fluorescencia les valió el Premio Nobel de Química al alemán Stefan Hell y a los estadounidenses Eric Betzig y William Moerner en 2014. Hoy se quiebra otro límite en la visualización.

Stefani, cuenta que hace varios años trabajan con Stefan Hell y que el primer autor del trabajo, Francisco Balzarotti, es egresado de la Facultad de Ingeniera de la UBA e hizo su doctorado en el Laboratorio de Electrónica Cuántica del Departamento de Física. “Esta publicación es producto de un proyecto colaborativo que empezó en 2011, cuando con Stefan Hell obtuvimos un subsidio partner group de la Sociedad Max Planck.  Francisco fue el primer involucrado en esta colaboración viajando a Alemania como postdoc y realizando un trabajo extraordinario. Durante todo este tiempo el proyecto fue desarrollándose de manera más elaborada y se sumaron investigadores de Alemania y Suecia”, añade el investigador que también es Vicedirector del Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION) de CONICET.

Uno de los desafíos del trabajo fue demonstrar fehacientemente la capacidad del nuevo método. “Gracias a simulaciones y mediciones con moléculas individuales bajo condiciones muy controladas, sabíamos que podíamos alcanzar una resolución de 1 nm o mejor.  El desafío era entonces tener una muestra de geometría controlada en tan pequeña escala. Para eso usamos otra tecnología que manejamos en el laboratorio, los origami de ADN”, comenta Stefani. Tal como describen los autores en el artículo, la súper-resolución pudo demostrarse haciendo imágenes de nanoestructuras de ADN. Estas muestras de material genético son estáticas y permiten poner fluoróforos en posiciones controladas y su estructura tiene una geometría muy precisa. Con estos nano-objetos pudieron demostrar que MINFLUX detecta la posición de cada fluoróforo y permite una imagen de ellos con altísima resolución.

Para conocer la posición de una molécula se necesita que esta emita fotones de fluorescencia, con MINFLUX se excita a la molécula con cuatro patrones de luz distintos.

Tecnología luminosa

Uno de los beneficios de MINFLUX, que los autores resaltan en el paper es que permite determinar la posición de moléculas usando muchos menos fotones de fluorescencia que cualquier otra metodología disponible. Cuando se estimula una molécula fluorescente con luz, ésta primero absorbe fotones y luego emite fotones de fluorescencia, de menor energía (y distinto color). En este proceso las moléculas poseen, de manera transitoria, por un cierto tiempo, una cantidad de energía extra que puede desencadenar reacciones químicas. Cuando esto ocurre, generalmente las moléculas pierden su capacidad de fluorescer. Este fenómeno se conoce como foto-degradación o foto-blanqueo,  es universal para todas las moléculas y limita el número de fotones de fluorescencia que uno puede obtener. Por este motivo el concepto de MINFLUX es tan importante. “Se aprovechó al máximo la información de cada fotón de fluorescencia; en vez de iluminar la muestra con una intensidad uniforme, se usaron patrones de luz de manera intermitente, específicamente con ceros de intensidad ubicados en posiciones predeterminadas y de manera intercalada. Así interrogamos dónde está la molécula”, profundiza Stefani en la metodología que resulta innovadora para el estudio.

Otra de las aplicaciones exitosas -luego del modelado y la obtención de imágenes con 1 nm de resolución - fue el tracking, es decir el seguimiento de los movimientos de proteínas dentro de una bacteria. “El tiempo se vuelve un factor clave para obtener buena información”, dice Stefani en relación al material biológico con el que trabajan, y agrega: “al necesitar medir menos fotones para ubicar a las proteínas, también las podemos ubicar más rápido! Pudimos observar como una proteína experimenta distintos tipos de movimientos, más rápidos o más lentos en distintos instantes. Si bien es algo que uno espera en la complejidad de una bacteria, este fenómeno no se puede visualizar con métodos convencionales”.

“Uno de los campos donde ya estamos trabajando es en extensiones de MINFLUX para obtener imágenes más grandes. En este momento el laboratorio pone su energía en desarrollar implementaciones de MINFLUX más amigables para los usuarios”, dice Stefani y enfatiza que esto recién empieza,  “el objetivo ahora es armar otro arreglo experimental en Argentina usando todo lo que aprendimos”.

Link al artículo de Science completo.

 COMUNICACIÓN DEPARTAMENTO DE FÍSICA - EXACTAS - UBA